Co-conception de systèmes d'imagerie pour l'extension de profondeur de champ Application à la localisation de molécule unique
Une grande majorité des systèmes d'imagerie est aujourd'hui constituée à la fois d'un système optique performant et de traitements numériques des images acquises. Nous pouvons citer par exemple l'appareil photo de nos téléphones portables ou encore des systèmes d'imagerie scientifiques modernes, comme les télescopes ou les microscopes. Concevoir conjointement le système optique et son traitement numérique est appelée co-conception. Cette approche, bien que difficile à mettre en œuvre, est devenue nécessaire pour améliorer les performances d'imagerie et réduire certaines contraintes liées à leur conception. Mes travaux de thèse, réalisés au sein de l'équipe Imagerie & Information du Laboratoire Charles Fabry, concernent l'extension de la profondeur de champ en microscopie par localisation en co-concevant des masques de phase binaires annulaires [T1]. Cette technique de microscopie à fluorescence, récompensée par le prix Nobel de Chimie en 2014, permet d'imager l'organisation de protéines dans une cellule vivante avec une résolution nanométrique et offre la possibilité de suivre leur dynamique au cours du temps.
Qu'est qu'une profondeur de champ ?
En théorie, un système d'imagerie ne comporte qu'un seul plan de netteté que l'on appelle communément plan de mise au point, ou plan focal. Comme illustrée à la figure 1, l'image d'un objet situé en avant ou en arrière de ce plan est considérée comme floue. On dit alors que l'objet est défocalisé. On admet en pratique une certaine tolérance de netteté et donc l'existence de deux limites situées de part et d'autre de ce plan. Tout objet se trouvant entre ces deux limites conduit alors à une image considérée comme nette. On appelle profondeur de champ la distance séparant ces deux plans.
Comment l'augmentons-nous habituellement ?
Mon travail visait à augmenter cette distance afin d'obtenir un système d'imagerie doté d'une profondeur de champ étendue. L'étendue de cette profondeur de champ dépend de plusieurs paramètres : l'ouverture du diaphragme de l'objectif, la distance de mise au point et les conditions d'observation. Comme la plupart de ces paramètres sont imposés par le matériel utilisé, l'ouverture reste le principal réglage qui permet de modifier la profondeur de champ d'un système d'imagerie. Elle est d'ailleurs souvent utilisée à cet effet en photographie. Cependant, diminuer l'ouverture diminue aussi l'éclairement et la résolution transverse de l'image. Cette méthode est donc rapidement limitée par les conditions réelles de la prise de vue : luminosité, vitesse d'obturation... Dans certaines applications, comme la microscopie à fluorescence, les conditions de luminosité sont si contraignantes que diminuer l'ouverture est en fait impossible.
La co-conception peut-elle servir à augmenter la profondeur de champ ?
En 1995, E. Dowski et W. Cathey proposent de co-concevoir un système d'imagerie pour étendre sa profondeur de champ sans en modifier l'ouverture. Cette approche repose sur l'ajout d'une lame de verre, appelée masque de phase, et d'un traitement numérique adapté des images acquises. À la manière d'un verre correcteur de lunette, le masque, dont l'épaisseur varie spatialement, introduit une modulation de phase permettant de modifier la réponse impulsionnelle du système. Les images ainsi produites sont invariantes à la défocalisation. La profondeur de champ du système est donc étendue.
En portant une attention particulière aux masques de variations d'épaisseur binaires et de symétrie de révolution (autrement dit, binaires annulaires), mes travaux ont permis de déterminer le couple optimal — design du masque + traitement — permettant d'atteindre les meilleures performances d'imagerie. Pour mener cette étude, j'ai distingué deux applications.
Application à la photographie computationnelle
Dans la première, le produit final est une image restaurée par un algorithme de déconvolution. J'ai montré que les masques binaires annulaires optimaux obtenus avec un critère linéaire (basé sur le filtre de Wiener) sont pratiquement identiques à ceux optimisés avec un critère plus complexe basé sur une méthode de déconvolution non linéaire [A2]. Ce résultat justifie une pratique fréquente de co-conception. Elle consiste à accélérer considérablement l'étape d'optimisation à l'aide d'un critère analytique simple. Les images acquises sont ensuite restaurées avec un algorithme non linéaire, pour obtenir une meilleure qualité image.
Application à la localisation de molécule unique
La seconde application, au cœur de mon travail de thèse, porte sur la microscopie par localisation de molécule unique, aussi appelée Single Molecule Localization Microscopy (SMLM). L'image acquise n'est plus restaurée mais sert à estimer une autre information : la position ou la présence d'un marqueur fluorescent individuel. J'ai donc proposé un critère d'optimisation des masques reposant non plus sur la qualité d'une image restaurée mais sur la précision avec laquelle un marqueur peut être localisé [A1].
Cette méthodologie, basée sur la borne de Cramér-Rao (BCR), permet d'optimiser des masques d'extension de profondeur de champ dans des conditions expérimentales réalistes. Ces conditions dépendent d'un certain nombre de paramètres optiques dont j'ai déterminé l'influence. J'ai ainsi mis en évidence les conditions expérimentales dans lesquelles les techniques d'extension de la profondeur de champ en SMLM peuvent être efficaces.
J'ai commencé par étudier l'influence des sources dominantes de bruit sur l'optimisation des masques. J'ai montré que les masques optimaux dépendent d'une grandeur appelée bilan photonique. Celui-ci est généralement faible puisque les masques de phase atténuent le signal de fluorescence. Je montre que, dans ces conditions, les masques optimisés en supposant un bruit additif gaussien (et non poissonnien) ont des performances proches de l'optimalité même lorsque le bruit de Poisson est dominant.
J'ai également vérifié que, dans la majorité des conditions expérimentales rencontrées en pratique, la BCR est un indicateur fiable de la précision de localisation [A4]. Lorsque la racine carrée de la BCR (RBCR) est inférieure à 20 nm, j'ai montré que l'estimateur du maximum de vraisemblance — standard pour un marqueur situé dans le plan focal ou adapté aux masques optimaux dans le cas contraire — atteint la précision de localisation prédite par la BCR. À l'inverse, si les conditions expérimentales sont telles que RBCR > 20 nm, les résultats publiés dans l'article [A4] peuvent être utilisés comme des abaques pour caractériser l'écart entre les performances réelles des estimateurs et la BCR.
J'ai ensuite amélioré l'environnement de simulation en prenant en compte un modèle de formation d'image plus réaliste que l'approximation quadratique (AQ), couramment utilisée dans la littérature pour représenter un défaut de mise au point. J'ai donc utilisé le modèle de Gibson et Lanni (GL). Celui-ci prend en compte de manière plus précise les aberrations optiques provenant de la forte ouverture numérique des objectifs de microscope et de l'écart entre les indices de réfraction du milieu biologique et du milieu d'immersion. L'utilisation de ce modèle exerce une influence importante sur l'optimisation des masques. Cependant, je suis parvenu à établir une relation d'équivalence simple entre les masques optimaux obtenus dans le cadre du modèle GL et ceux obtenus à partir du modèle AQ [A3]. Ce résultat permet d'optimiser des masques génériques sans avoir besoin de connaître précisément tous les paramètres optiques du microscope.
Pour finir, je me suis intéressé à la chaîne de traitement complète des images SMLM pour déterminer l'influence des masques de phase sur l'étape de détection. Cette étape, aussi appelé pré-localisation, précède toujours l'étape de localisation sous-pixellique des marqueurs fluorescents. J'ai proposé un nouveau critère d'optimisation basé sur la distance de Bhattacharyya pour déterminer le masque qui maximise la probabilité de détection d'un fluorophore dans un volume imagé. Cette étude a révélé que, pour un bilan photonique faible, les masques optimaux pour la détection sont similaires à ceux optimisés pour la localisation [A6].
Malgré les contraintes et le retard liés à la crise sanitaire, j'ai eu la chance de pouvoir commencer la validation expérimentale des masques de phase binaires annulaires pour l'extension de la profondeur de champ en imagerie à molécule unique. Ce travail a été réalisé avec la collaboration de l'équipe Nano-BioMicroscopy du Laboratoire Photonique, Numérique et Nanosciences à Bordeaux. L'extension de la profondeur de champ apportée par mes masques a pu être testée en conditions réelles sur le système illustré à la figure 2.
Les résultats de ces expériences ont confirmé la pertinence de cette approche et ont ouvert des perspectives intéressantes aujourd'hui explorées par plusieurs thèses. L'efficacité de mes masques a d'ailleurs été démontré par Quentin Grésil de l'équipe Nano-BioMicroscopy dans une expérience de single-particle tracking [A5].
L'ensemble de mon travail m'a conduit à publier dans différentes revues scientifiques, à participer à des congrès scientifiques internationaux [C1-3] et à encadrer plusieurs stages. Je remercie le GdR IASIS (Information, Apprentissage, Signal, Image et ViSion) pour son soutien au travers de l'appel à projets 2019.
Publications dans des revues scientifiques
- [A1]
- O. Lévêque, C. Kulcsár, A. Lee, H. Sauer, A. Aleksanyan, P. Bon, L. Cognet, and F. Goudail, "Co-designed annular binary phase masks for depth-of-field extension in single-molecule localization microscopy," Opt. Express 28, 32426-32446 (2020)
- [A2]
- O. Lévêque, C. Kulcsár, and F. Goudail, "Comparison of linear and nonlinear deconvolution algorithms for co-optimization of depth-of-field enhancing binary phase masks," OSA Continuum 4, 589-601 (2021)
- [A3]
- O. Lévêque, R. Duverger, H. Sauer, C. Kulcsár, and F. Goudail, "Influence of high numerical aperture on depth-of-field enhancing phase mask optimization in localization microscopy," J. Opt. Soc. Am. A 38, 1380-1390 (2021)
- [A4]
- O. Lévêque, C. Kulcsár, A. Lee, P. Bon, L. Cognet and F. Goudail, "On the validity domain of maximum likelihood estimators for depth-of-field extension in single-molecule localization microscopy," J. Opt. Soc. Am. A 39, 37-43 (2022) Editors' Pick
- [A5]
- Q. Gresil, A. Lee, O. Lévêque, K. Caicedo, B. Martín Muñoz, C. Kulcsár, F. Goudail, P. Bon and L. Cognet, "A Binary Annular Phase Mask to Regulate Spherical Aberration and Allow Super-Localization in Single-Particle Tracking over Extended Depth-of-Focus," Optics Communications (2023)
- [A6]
- O. Lévêque, C. Kulcsár, L. Cognet and F. Goudail, "On the equivalence of binary phase masks optimized for localization or detection in extended depth-of-field localization microscopy," J. Opt. Soc. Am. A 40, 1753-1761 (2023) Editors' Pick
Actes de conférence internationale
- [C1]
- O. Lévêque, C. Kulcsár, H. Sauer, A. Lee, P. Bon, L. Cognet, and F. Goudail, "Can phase masks extend depth-of-field in localization microscopy?," Proc. SPIE 11351, Unconventional Optical Imaging II, 113510E (13 October 2020)
- [C2]
- O. Lévêque, C. Kulcsár, A. Lee, P. Bon, L. Cognet, and F. Goudail, "How to assess depth-of-field extension strategies applied to single-molecule super-resolution microscopes?," in OSA Imaging and Applied Optics Congress 2021 (3D, COSI, DH, ISA, pcAOP), OSA Technical Digest (Optical Society of America, 2021), paper CF4B.5
- [C3]
- O. Lévêque, C. Kulcsár, and F. Goudail, "Can better performance be obtained when an imaging system is co-optimized with a nonlinear deconvolution algorithm?," Proc. SPIE 11866, Electro-Optical and Infrared Systems: Technology and Applications XVIII and Electro-Optical Remote Sensing XV, 118660A (13 September 2021)
Thèse de doctorat
- [T1]
- O. Lévêque, "Co-conception de systèmes d'imagerie pour l'extension de profondeur de champ — Application à la localisation de molécule unique," PhD Thesis, Université Paris-Saclay (2022) Prix de thèse 2023 GS SIS